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產(chǎn)品簡(jiǎn)介 ：
    活性氧(Reactive oxygen species, ROS) 包括超氧自由基、 過氧化氫、 及其下游產(chǎn)物過氧化物和羥化物(O2? ? ,H2O2, ?OH, ONOO ? , ?NO)等，參與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用
2,7-dichlorofluorescin diacetate (DCFH-DA)是迄今常用、靈敏的細(xì)胞內(nèi)活性氧檢探針。DCFH-DA 沒有熒光，進(jìn)入細(xì)胞后被酯酶水解為 dichlorofluorescin (DCFH)。在活性氧存在時(shí) DCFH 被氧化為不能透過細(xì)胞膜的強(qiáng)綠色熒光物質(zhì) dichlorofluorescein (DCF)，其熒光在激發(fā)波長(zhǎng) 502 nm，發(fā)射波長(zhǎng) 530 nm 附近有大波峰，強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平成正比。此活性氧檢測(cè)系統(tǒng)本底低，靈敏度高，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便。
本試劑盒適于熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等圖像檢測(cè)，熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀、流式細(xì)胞儀定量 ROS 檢測(cè)。

作波長(zhǎng)：
適宜激發(fā)波長(zhǎng) 500、485 (500 ± 15 nm)，適宜發(fā)射波長(zhǎng) 525 (530 ± 20 nm)。也可按照 FITC 熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。

操作步驟 ：
一 、 試劑準(zhǔn)備 ：
    1. DCFH-DA 可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。 血清或培養(yǎng)基顏色并不影響 DCFH-DA 及細(xì)胞內(nèi)熒光產(chǎn)生， 但可能會(huì)影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀或流式細(xì)胞儀熒光測(cè)定。可將 DCFH-DA 稀釋于無酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如 PBS 中。這依賴于使用何種熒光設(shè)備進(jìn)行測(cè)定。
    2. 加入 DCFH-DA 的時(shí)機(jī)或孵育時(shí)間，以終能順利檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)活性氧為目的。藥物處理時(shí)間較短(<2小時(shí))或預(yù)計(jì) ROS 效應(yīng)較弱，可先加或同時(shí)加入 DCFH-DA。反之，treat 刺激時(shí)間較長(zhǎng)(>6 小時(shí))或預(yù)計(jì)產(chǎn)生ROS 效應(yīng)較強(qiáng)，可后加 DCFH-DA。
    3. 活性氧供體含高純度 12 mM H2O2。加入細(xì)胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產(chǎn)生其它類型的活性氧，均可使 DCFH-DA 氧化為 DCF 呈現(xiàn)強(qiáng)綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測(cè)試實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)或儀器的陽(yáng)性試劑，以初步觀察細(xì)胞活性氧所產(chǎn)生的熒光的一般特征，并且也可以將該實(shí)際作為實(shí)驗(yàn)的一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照。推薦該試劑的細(xì)胞工作濃度為 20~100 µM 或更低濃度，但超過 200µM 將產(chǎn)生細(xì)胞毒。如果用戶熟悉 ROS 熒光或?qū)嶒?yàn)沒有必要采用陽(yáng)性對(duì)照，可以不加該試劑。
二 、 加入熒光探針 ：
    1. 加入 DCFH-DA 于培養(yǎng)基，推薦初始工作濃度為 10 µM。對(duì)不同的細(xì)胞和處理，DCFH-DA 工作濃度可為 100 nM~20 µM，需進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的濃度。總體稀釋倍數(shù)應(yīng)在 1:500~1000 以上以避免 DMSO 對(duì)細(xì)胞的影響。以 DMSO 作為溶劑對(duì)照。
    2. 37 ºC 孵育細(xì)胞 30min~幾個(gè)小時(shí)，通常 30-60min 即可。孵育時(shí)間長(zhǎng)短與細(xì)胞類型、刺激條件、DCFH-DA 濃度有關(guān)。
    3. PBS 洗滌細(xì)胞 2 次。
三 、 熒光檢測(cè)
    采用熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡圖像檢測(cè)照相，綠色熒光強(qiáng)度代表活性氧水平。也可進(jìn)行微板熒光分析儀(multiwell fluorescence plate reader)實(shí)時(shí)或每 10 分鐘分時(shí)逐點(diǎn)檢測(cè)熒光強(qiáng)弱。對(duì)于流式細(xì)胞儀可將細(xì)胞用胰酶消化 PBS 洗滌后重懸檢測(cè)。

相關(guān)文獻(xiàn)：

《Gecko Active Components Regulates Endoplasmic Reticulum Stress to Induce the Apoptosis of KYSE150 Cells through PERK Pathway》 作者:Yimeng Duan, Lengxin Duan, Zeyue Huang, Bingbing Wang, Jiangang Wang 期刊:Journal of Biosciences and Life Sciences 影響因子:0.552 PMID:
《Medicinal supplement genipin induces p53 and Bax?dependent apoptosis in colon cancer cells》 作者:Jingwang Ye, Jing Li, Xiangfeng Wang, Ling Li 期刊:Oncology Letters 影響因子:1.871 PMID:30127884
《Cell death induced by α-terthienyl via reactive oxygen species-mediated mitochondrial dysfunction and oxidative stress in the midgut of Aedes aegypti larvae》 作者:Jie Zhang,Shakil Ahmad,Lan-Ying Wang,Qian Han,Jian-Chun Zhang,Yan-Ping Luo 期刊:Free Radical Biology and Medicine 影響因子:5.657 PMID:31022448
《白頭翁湯正丁醇提取物誘導(dǎo)白念珠菌生物被膜細(xì)胞凋亡》 作者:施高翔， 汪云霞， 馮鑫， 邵菁， 汪天明 期刊:中國(guó)真菌學(xué)報(bào) 影響因子:0.576 PMID:
《Autologous decellularized extracellular matrix protects against H2O2-induced senescence and aging in adipose-derived stem cells and stimulates proliferation in vitro》 作者:Xiaofang Yu, Yucang He, Zhuojie Chen, Yao Qian, Jingping Wang, Ziwan Ji, Xiaoyan Tan, Liqun Li, Ming Lin 期刊:Bioscience  Reports 影響因子:2.535 PMID:31048361
《In vitro evaluation of the neuroprotective effect of oligo-porphyran from Porphyra yezoensis in PC12 cells》 作者:YingJuan Liu，Zhenzhen Deng，Lihua Geng，Jing Wang，Quanbin Zhang 期刊:Journal of Applied Phycology 影響因子:2.635 PMID:
 

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