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堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)

自備材料：
1、載玻片、濕盒
2、普通光學顯微鏡
產(chǎn)品簡介
       堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase，簡稱 ALP 或 AKP)為一類磷酸酯酶，廣泛分布于哺乳動物組
織內(nèi)，其活性所需適 pH 9.2~9.8。此酶主要存在于物質(zhì)交換活躍之處(細胞膜)，如腸上皮和腎近曲小管的刷狀緣、附睪上皮之靜纖毛、肝的毛細膽管膜以及微動脈和毛細血管動脈部之內(nèi)皮，還見于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體、吞飲小泡、腸上皮之溶酶體、中性粒細胞之中性顆粒以及平滑肌之細胞膜。不是采用金屬沉淀法來顯示堿性磷酸酶活性，而是采用偶氮偶聯(lián)法(又稱同時偶聯(lián)法)，其原理是在 pH9.2～9.8 的堿性條件下，細胞內(nèi)堿性磷酸酶可使 AB-BI 磷酸鹽水解，釋放出磷酸與萘酚，后者與偶聯(lián)重氮鹽生成有色產(chǎn)物，定位于細胞質(zhì)中。該染液可用于血液、骨髓或細胞涂片、冰凍切片、梯度入水后的石蠟切片等的堿性磷酸酶染色，堿性磷酸酶活性部位呈藍色，位于胞槳，結(jié)果較金屬鹽沉淀法可靠。

操作步驟：
一、涂片或切片
1、 血液、骨髓或細胞涂片、冰凍切片、石蠟切片入ALP固定液固定3min(梯度入水后的石蠟切片無需固定)，水洗。
2、 滴加配制好的 ALP 孵育液，放入濕盒中，避光孵育 15～20min，水洗。
3、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染 3～5min。
4、 水洗、鏡檢或甘油明膠封固后鏡檢。
二、貼壁培養(yǎng)細胞
1、 取6孔板或其他容器培養(yǎng)的細胞，棄液，PBS清洗干凈。
2、 加入ALP固定液固定3min或4%多聚甲醛固定10～15min，PBS清洗。
3、 滴加配制好的 ALP 孵育液，放入濕盒中，避光孵育 15～20min，PBS 清洗。
4、 入核固紅染色液或甲基綠染色液復(fù)染 3～5min。
5、 PBS 清洗、鏡檢。

染色結(jié)果：
ALP 活性部位 藍色
細胞核 紅色(核固紅)或綠色(甲基綠)
血液、骨髓涂片結(jié)果判斷：
一般以積分報告結(jié)果，根據(jù) 100 個中性粒細胞陽性顆粒進行 0-4 計分。
細胞分值 染色特點
0 無顆粒
1 稍有顆粒
2 中等程度顆粒
3 多數(shù)顆粒
4 充滿顆粒

注意事項：
1. 血液或骨髓細胞涂片或其他樣本均應(yīng)新鮮，薄厚適宜，及時固定，否則會影響酶的活性。
2. 培養(yǎng)細胞染色操作過程中，清洗、染色等步驟都應(yīng)輕微，以免損傷或丟失細胞。
3. ALP 孵育液易失效或降低陽性強度，即配即用，不宜久置。
4. 復(fù)染時，核固紅染色液或甲基綠染色液二者取其一。
5. 每次染色時，應(yīng)有陽性對照片。

相關(guān)文獻：

《Hedgehog pathway inhibition causes primary follicle atresia and decreases female germline stem cell proliferation capacity or stemness》 作者:Yu Jiang, Dantian Zhu, Wenfeng Liu, Qiushi Qin, Zhi Fang and Zezheng Pan 期刊:Stem Cell Research & Therapy 影響因子:4.627 PMID:31277696

堿性磷酸酶染色液(偶氮偶聯(lián)法)